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纤维素检测技术的发展历史(综述) —— 纪念Weende温氏法-纤维分析技术160周年

  • 分类:科普知识
  • 作者:李健(中国格哈特);陈奕(广东省农科院/中国格哈特)
  • 来源:
  • 发布时间:2021-06-04 16:48
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纤维素检测技术的发展历史(综述) —— 纪念Weende温氏法-纤维分析技术160周年

  • 分类:科普知识
  • 作者:李健(中国格哈特);陈奕(广东省农科院/中国格哈特)
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(2020-10)
格哈特(Gerhardt)见证了纤维素分析技术发展的全过程

纤维素(Cellulouse)及其分析技术的基本知识:
糖,我们太熟悉了,一谈到它就会流口水,有葡萄糖呀、果糖、蔗糖等,还知道由多个葡萄糖组成的淀粉(多糖),它们给我们提供甜味,更重要的是主要能量来源的碳水化合物。我们却很不愿意去想“纤维素”也是葡萄糖组成的多糖,因为它不被消化,吃进去多少拉出来多少,太不可思议了。
纤维素我们没理由不去认识它,因为他是自然界最多的天然物质,植物界50%以上的碳源。当它被冠以“膳食纤维”头衔时,还成为我们最重要的七种营养素之一,所以我们需要分析研究它。
我们检测“纤维素含量”,其实不仅仅是纤维素,还有半纤维素、果胶质和某些功能性的聚合糖。他们都是糖类物质,我们分析“纤维素含量”还涉及到自然界第二大量的物质木质素,所有这些物质共同作用,组成了植物的纤维,是植物形状的骨架。当它们作为食物给人和动物食用,就成为膳食纤维。
虽然人们发现“纤维”已经350多年,研究纤维已经200多年,研究膳食纤维也有60多年,可把膳食纤维确定叫做“第七营养素”才不到10年时间……科学在发展,我们应该感恩科学的发展,我们纪念“纤维及其分析技术”,还因为它是有机化学乃至高分子化合物科学发展的起因,是草食动物重要的碳水化合物营养源和其他动物重要的功能性营养源。

 

2013年纤维素从食物中的废物变成了第七营养素

盛世当今,我们的日子越来越好,生活物资越来越丰富,人们也越来越关注食品和饲料的营养。我们知道食品/饲料的营养成分有七大类:蛋白质、脂肪、糖、维生素、水和无机盐(矿物质),以及“新贵”纤维素,2013年才被国际公认(确定)。我们之前纪念过蛋白质含量测定技术、脂肪含量测定技术,今天,我们就来聊一下这个新贵营养素——纤维素。
蛋白、脂肪、糖/纤维是人和动物食物中提供能量的营养素,也称为宏量营养素,其它除了水之外都被称为微量营养素,这也就是我们把分析测定蛋白质、脂肪和纤维素含量称为三大营养品质的分析的原因。这三大营养品质分析测定技术,迄今都已超过100年的历史,世界上目前仅有德国格哈特分析仪器公司全过程的见证和参与了这三大技术的发展,值此纤维测定技术发展160年之际,我们责无旁贷应该来回顾这项技术的发展历程,以示纪念。

 

分析纤维素已有200多年,我们纪念其分析方法才160年

奇怪了吧?纤维素这个物质以及其分析技术,历史已经超过200年,我们为何说纪念这个物质的分析方法才160年?那是因为当年发现并研究纤维素,是为了利用这个自然界最大量的天然物质,并因此发展出有机化学,高分子化学。是160年前德国Weende实验室把纤维素含量作为饲料营养评价体系中的指标并归范了(粗)纤维素含量测定方法,后人一直以该方法作为参比方法所致。

纤维素含量应用于反刍动物营养评价早于其它营养素,怎么却成了“新贵”?因为纤维素对于人类和动物其实都是“粑粑”,吃进去却消化不了。草食性动物是因为体内共生了一个细菌“超级大国”,它们消化了纤维,并把它们的“粑粑”——糖甩给了寄主,寄主得益于它们的“粑粑”而生长发育,当然人和动物还因为纤维清洁了肠胃,提高了肠胃吸收功能并带走了有害物质,对现代人乃至畜牧动物的健康起到“决定性”的作用,比其它真正的营养成分更“营养”,还升级到被称为第七营养素这个新贵。

 

 

人们真正对纤维感兴趣而开始研究它,源自1672年Nahemiah Grew定义了植物纤维(一类有别于淀粉的多糖物质),人们因此知道了植物的“骨架” ,这个历史已经超过200年。1806年Einhof用稀酸碱处理植物分析不溶解的成分,该成分在1815年被Dave Murray定义为“粗纤维”,进而在1816年形成了相对规范的方法,人类开始了有机高分子化合物化学的研究。而粗纤维分析方法真正形成现在的纤维素含量测定参比方法源于1860年德国温德(Weende)农业试验站。

话说1857年7月18日,汉诺威国王(德国之前的文明)乔治五世(König Georg V.)在德国北部小城哈默尔恩(Hameln),主持了皇家汉诺威农业协会一个长时间的讨论,决定哥廷根市(Göttingen)的温德镇(Weende)成立哥廷根-温德农业试验站(Die ehemalige Versuchsstation Göttingen-Weende),专注动物营养与动物生理学方面的科学研究——世界上首家专注于饲料营养研究的机构。此试验站就是现在粗纤维参比标准方法——Weende’s method(温氏法)的源头,后划归哥廷根大学(Georg-August-Universität Gttingen)。

 

纤维素分析方法并非Weende发明,怎就叫温德法?

温德农业试验站的首任站长是动物营养生理学家汉尼伯格(Johann Wilhelm Julius Henneberg) ,德国著名化学家李比希(Justus von Liebig,肥料工业之父,有机化学学科创始人,发现了氮对植物营养的重要性,还是燃烧定氮法的第一发明者)的学生,德国哥廷根大学动物营养学首任首席专家,德国科学动物营养学的创始人。当今纤维测定的参比方法“温氏法——酸碱消煮洗涤法”就是在他的主持下系统提出和应用,业内因此习惯称为Weende’s Method(温氏法),清晰明了而方便。

纤维测定方法的原理是德国农业化学家艾因霍夫(Heinrich•Einhof)提出,他于1806年在勃兰登堡的莫格林镇(Moglin) 第一次使用有机溶剂、稀酸、稀碱依次处理蔬菜和猪饲料样品,得出不可消化物质含量。其挚友德国农学家特尔(Albrecht•von•Thaer)于1809年首次使用艾因霍夫的方法评价猪饲料的营养价值。1859年汉尼伯格质疑了艾因霍夫的纤维测定方法存在问题,并与其助手司徒门(Friedrich Karl Adolf Stohmann)在温德农业试验站进行方法改进,于1860和1864年两次发表论文《反刍动物合理喂养的贡献:实用农化生理学研究(Beiträge zur Begründung einer rationellen Fütterung der Wiederkäuer : Praktisch-landwirthschaftliche und chemisch-physiologische Untersuchungen)》中推出改良的粗纤维测定方法——这就是Weende’s method(温氏法,也称温德法)。
 

温德农业试验站提出了粗纤维CF与水分、粗蛋白CP、粗脂肪EE、灰分ASH、无氮浸出物NFE一起,作为饲料中六种概率养分,通过测定它们的含量,对饲料做概略分析(Feed Proximate Analysis),来评价饲料营养。这一方法被称为Weende饲料分析体系,是评价饲料营养的经典体系且沿用至今。粗纤维含量的酸碱消煮方法,也因此被广泛使用并成为公认的经典,习惯用Weende冠名,我们现代人很多人都不知道这个概念,还以为是叫Weende的人发明的。虽然温氏法非常难以获得稳定的结果,并且是很粗略地纤维素测定方法,实际上在最现代的费伯包(FibreBag)技术之前,甚至就没有多少人能很有信心的做出稳定的结果,可就因为它是现在依然权威的“温氏饲料营养评价体系”的基础数据,而迄今为止依然是没有争议的参比级标准测定方法。
 

纤维素分析方法160年的发展史
从1860年到2020年,160年的时间匆匆而过,纤维的成分及内涵早已清楚,而其检测技术却在不停顿的发展中,基本形成了三大分析技术和五代设备技术手段,下面让我们一起来回顾一下我们对纤维的认识和检测技术的发展:
纤维的成分和叫法
纤维素(Cellulose)D-葡萄糖以β-1,4糖苷键组成的大分子多糖;
半纤维素(Hemicelluloses):多种糖以β-1,4糖苷键组成的大分子多糖;
果胶质(Pectin):由D-半乳糖醛酸以d-1.4糖苷键相连形成的无定形胶质;
木质素(Lignin):由对香豆醇、松柏醇、芥子醇随机聚合形成的一种复杂无定形酚类聚合物,永远与纤维素和半纤维素交联在一起,共同构成植物的骨架;
粗纤维素含量(CF):用温氏法(酸碱浸提法)测定的结果,其实是包含部分纤维素,部分半纤维素和全部木质素,其总量和实际纤维素的总量接近,用于代表纤维素的含量,这也就是“粗”字的意思。这个方法虽然现代人颇不愿接受,但至今依然是参比方法,只是要获得基本准确且稳定的结果,很考验分析者本人,现代人受不了,有点吃不到葡萄就说葡萄酸的意思;
中性洗涤纤维(NDF):用范氏法(洗涤剂法)的中性洗涤剂消煮后,基本保留了所有的半纤维素、纤维素和木质素,这是(不溶性膳食纤维)的基本成分,现代人越来越喜欢;
酸性洗涤纤维(ADF):用范氏法(洗涤剂法)的酸性洗涤剂消煮后,NDF中的半纤维素就留不住了,所以用NDF-ADF就可以获得半纤维素的总量,现代人也比较喜欢;
酸洗木质素(ADL):经过范氏法测定的NDF或者ADF,只要用72%的硫酸浸泡3小时以上,纤维素就被消解掉了,剩下的就是完整的木质素。因为这是用酸浸洗的木质素,与木材行业用碱洗的木质素有些区别,所以一般叫酸洗木质素。由此可知,ADF-ADL就可以得到完整的纤维素。这个范氏洗涤方法获得的纤维成分结果也比粗纤维的稳定很多,所以,方法虽然麻烦,现代人还是喜欢,越来越多做饲料营养分析的人喜欢用NDF配合ADF来做营养评价。
不溶性膳食纤维(IDF):用特沃法(酶解法)酶解后的残渣(除去残留蛋白和灰分)后的残渣,其基本成分就是NDF所得的结果,这也就是膳食纤维酶解法(1976)出现了这么多年,人们还是喜欢用更加方便且清晰可靠的NDF来代表IDF的主要原因;
可溶性膳食纤维(SDF):用特沃法(酶解法)酶解后的溶液(其固形物是不溶性膳食纤维),用高浓度酒精(乙醇)凝沉后的残渣部分,同样要除去残留蛋白和灰分。这部分成分在天然样品中占有的量往往比较少,少到可以忽略不计,但是,在现在研究膳食纤维功能食品乃至营养价值评价中,越来越重视食物的功能性而非一般成分分析的时代,人们发现IDF似乎有些特殊功能,尤其是在功能食品加工中人为制造出了很多类似纤维的“营养素”功能并更加突出的功能,这部分虽然同样不能被人体或动物吸收,而且可溶,但却可以赋予一些特殊的功能或价值,其成分主要是未完全降解的多糖或者碳链很短的低聚糖、寡聚糖及其衍生物,尤其是现在人工合成的一些小碳链甚至异形的糖类物质。可实际上很多人工添加的膳食纤维是特沃法酒精都无法凝沉的物质,使得酶解法的IDF并不一定能有效代表(可溶性的)膳食纤维;
总膳食纤维(TDF):用特沃法(酶解法)酶解并经由高浓度酒精凝沉后的残渣(除去残留蛋白和灰分),也就是可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维的总和。其基本成分相当于NDF所得的结果加上那些低聚糖,结合糖等成分,视食品中人工加工和添加的工艺引起的变化而可能有大的变化,而天然物质中TDF和IDF(NDF)的结果一般都很接近。除非特别要求,基本可以用简单得多的范氏法NDF代替。但是,现在的标准方法,越来越多的向酶解法方向走,似乎摒弃了标准方法是以最实用最有可比性为首要依据这个原则。

纤维分析的三大技术和五代设备技术的发展:

  • Weende’s Method(温氏法):测定粗纤维

1860年,德国温德农业试验站首先把先人的酸碱洗涤法做了系统优化,限定了方法条件,并作为他们Weende饲料评价法的基础指标方法,确定作为植物中纤维素含量的测定方法,采用玻璃纤维做过滤载体;

    1861年,格哈特供应的温氏法粗纤维检测装置(原始级),使用亚麻布做滤布进行过滤,实验结果相对稳定并容易操作些;

    1884年,Weende评价法再次系统介绍了粗纤维测定法,采用了亚麻布滤布后砂芯坩埚的方案。现在的标准方法是第一步用布氏漏斗上铺尼龙滤布或者砂芯坩埚上铺上硅藻土,第二步用砂芯坩埚铺上硅藻土的方法;

 

 

1886年,AOAC 收录了Weende粗纤维测定方法;20世纪上半页,随着粗纤维测定方法的普及应用,业内开始对纤维测定检测设备需求增强,纤维测定的仪器技术开始发展;

1910年,出现了联体组合纤维测定装置,那是业内第一代纤维测定仪,也是现代手工传统方法的基本模型; 

1960年代,人们发现纤维素不仅仅对草食动物有用,对其它动物尤其是人类都很有相关,科学界提出膳食纤维概念,开始了人类营养价值的研究;

  • Van Soest Method(范氏法):测定洗涤纤维,膳食纤维

1963年,Peter van Soest博士参与了对植物纤维做精细化分析的研究,提出了用表面活性剂(洗涤剂)来洗涤植物组织研究其纤维成分的方法,即纤维测定的范氏 (Van Soest) 法,也称洗涤纤维法,这个方法也是因为膳食纤维分析而大力发展。范氏法采用的设备技术与温氏法完全一样;

  • Trowell Enzyme Method(特沃法):酶解法测膳食纤维

1976年,膳食纤维测定标准方法Trowell法(特沃法)公布,也就是我们常称的酶解法膳食纤维测定。但是,因为该方法在那个时候相对复杂和要求较高,一直只是做精细研究用。大家开始重视特沃法,始于21世纪对功能食品的高要求和市场管理需求。

酶解法所用的设备技术基本与洗涤法(温氏法和范氏法都是洗涤法)存在很大差异,其设备技术在20世纪基本没有太多的发展,很少有人探讨其设备技术。也因此在纤维测定技术业界,探讨的设备技术时代,基本没有人考虑到酶解法膳食纤维的测定,2010年之后,膳食纤维分析系统才进入纤维分析的视野,所以业内讨论的设备技术时代,基本都是针对洗涤法;

1976年,一体化的滤板式纤维测定仪出现,是业内第二代纤维测定仪。滤板式纤维仪是纤维分析仪器的一个重大发展。
科技的发展,出现砂芯坩埚,纤维测定可以通过在砂芯坩埚上铺设玻璃纤维或者硅藻土而避免再次转移的麻烦和增加误差,成为现代标准方法的依据。

因为使用玻璃纤维对纤维要求严格,操作也需要专业,其最大优势是样品清洗掉酸碱很容易。采用硅藻土做滤层,操作简单而没有技术要求,可比性明显可以提高,但是,硅藻土比较能以洗到中性也备受纠结,但用硅藻土滤层过滤,硅藻土能够形成相对稳定的滤板,一旦过滤受阻(附上纤维肯定会堵死的),还可以剥开表层继续保持滤板的透性。只要不把滤板弄穿,滤层的稳定性就能够得到保障。

一体式滤板式纤维测定仪,把硅藻土滤板整合到砂芯坩埚中,并把砂芯坩埚作为消煮容器,虽然坩埚会因为酸碱腐蚀而孔径变化,理论上有硅藻土滤层的保护而可以避免影响结果(实际上因为堵塞,不得不反吹破坏滤层,操作还是难以有保障),并避免了反复转移样品带来的误差,有效的提高了检测重现性,纤维测定从此进入仪器化发展时代;

1977-1984年间,AOAC陆续发布了多个膳食纤维的测定方法,给酶解法膳食纤维的方法进行了确认。这期间开始有人研究酶解法膳食纤维仪器设备。本文主要在于纪念温氏法应用160年,暂不多谈特沃法的技术发展; 

1991年,针对滤板式纤维仪存在的一些过滤问题以及检测通量难以提高等问题,可能是受到袋泡茶茶包的启发,出现了Filter Bag无纺布滤包技术滤包式高压锅纤维测定仪,是业内第三代纤维测定仪,很有效的提高分析通量,后来形成了自动化,是业界首台实现纤维浸提测定自动化的仪器。
这个技术虽然明显存在和标准方法原理相悖的高压问题,但该方法获得了支持研发者一些列的“验证”结果,显示其结果和标准方法相当,给科研和检测机构极大的振奋,文献检索,可以检索到在那段时间(约5年)有大量的科学文献发表。后来人们渐渐发现其检测结果很难重现,很多科学实验发现结果判断有错误,检测机构更因为实际检测重现性难以控制,不敢贸然报告结果,该方法更多是作为数据内控方面应用; 

1994年,针对滤包法需要高压条件,存在与标准有异议的问题,业内进入纠结到底是用回滤板式还是继续滤包式纤维测定仪的时代,引发了新的设备技术研发。

波恩大学的教授在格哈特实验室开发出了Capsule滤杯式纤维测定仪,很有效的解决了滤包需要高压防止爆袋的问题,而是用滤杯密封,透气的上盖不浸入溶液,并且采用编织滤网来确保过滤孔径的高度一致,解决无纺布滤布孔径不够均匀的问题,是业内第四代纤维测定仪。这产品一经推出,一度振奋人心,人们甚至发现一天完成上百份样品的纤维分析都不成问题。数年后,渐渐地人们又发现该技术存在另一种难以解决的技术难题。现在这一技术已经基本退出历史舞台; 

 

2002年,市场的需求,科技就有发展。一种改良的滤袋式纤维测定技术——FibreBag®️费伯包技术推出,总结了前面几代的技术特点和技术缺陷,综合解决了前人出现的所有问题,巧妙的采用开放式滤袋并用支撑架把滤袋撑起,发挥了滤杯技术的优势,采用上部开口可检查的形式而彻底解决了滤包高压的问题、滤杯无法发现样品异常的问题,高效操作的优势和清晰无疑的可重现原理和实际验证,费伯包技术真正接替了先前数代技术,开始了崭新的新一代纤维测定技术,这是目前业界最新的第五代纤维测定仪技术; 

2006年,费伯包技术发展到全自动化仪器技术,世界上出现首台符合标准法的全自动纤维测定仪问世,操作简单到操作人员仅需制备样品、称量样品和一些必要的操作(装机上样,批量移动到烘箱、到马弗炉等)整个浸提洗涤过程全由一个固定的程序控制,所有样品分析条件高度一致化,解放了繁琐和易产生误差的浸提洗涤操作,基本上一般人员就可以操作获得和专业技术人员相同的结果。

时至今日,世界上还没有更新的技术,滤袋技术产品目前也未发现有任何缺陷,一台仪器日分析处理量可以达到60个样品以上,也是目前备受瞩目的理由。费伯包技术,还完全满足各种标准的参比方法:温氏法、范氏法和特沃法,是全功能的纤维测定技术。

2020年,洗涤法纤维测定技术的代表“温氏法”发布正好160年,我们谨借此文,纪念这一分析技术——世界上几乎绝无仅有的一种能够延绵这么多年而不衰的理化分析技术。我们可以看到这一技术,最近的10多年还有划时代的新发展,并且似乎有越发重要的技术应用,不仅在科研和社会需求上的应用而发展,而且还已经越来越接近于“日常生活”需求的地位。我们在动物饲料上的营养配方研究,越来越重视各种纤维的精细作用;我们的人类生活,早已解决了温饱果腹的时代,现在竟然把食用了100多年的“废物”当作最重要的营养素,也因此,我们更直接的用控制纤维各成分含量的的方式,直接进行植物产商品的“品质”生产,例如:我们检测蔬菜的纤维含量,控制蔬菜的鲜嫩度;用监测各种纤维素的含量,控制植物性食品的品质和价值……

 

 

 

(本文主要撰稿人:李健,中国格哈特,陈奕,广东省农科院/中国格哈特,欢迎指导交流。如果有表述错误,实属水平有限,欢迎随时批评指正。2021年5月修缮,作为格哈特175周年庆的贺礼!)

 

 

 

 

 

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